2 ×ປະສົມ PCR ທີ່ອຸດົມດ້ວຍ GC

ແມ່ແບບ A-1

template ແມ່ແບບປະກອບດ້ວຍສິ່ງປົນເປື້ອນທາດໂປຼຕີນຫຼືຕົວຍັບຍັ້ງ Taq, ແລະອື່ນ — —— ເຮັດຄວາມສະອາດແມ່ແບບ DNA, ກຳ ຈັດສິ່ງເປິເປື້ອນຂອງໂປຣຕີນຫຼືສະກັດເອົາແມ່ແບບ DNA ອອກພ້ອມກັບຊຸດເຄື່ອງກັ່ນຕອງ.

■ການປະຕິເສດແມ່ແບບບໍ່ສົມບູນແບບ - ເພີ່ມອຸນຫະພູມທີ່ມີຄວາມບໍ່ສົມດຸນຢ່າງເiatelyາະສົມແລະຍືດເວລາຂອງການເຮັດໃຫ້ມີການຄໍ້າປະກັນໄດ້ຢ່າງເາະສົມ.

rad ການເສື່ອມສະພາບຂອງແມ່ແບບ —— ກະກຽມແມ່ແບບຄືນໃ່.

A-2 Primer

quality ຄຸນນະພາບທີ່ບໍ່ດີຂອງ primers —— ສັງເຄາະສີ primer ຄືນໃ່.

rad ການເສື່ອມປະສິດທິພາບຂອງ primer —— ລວບລວມເອົາ primers ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມສູງໃສ່ໃນປະລິມານ ໜ້ອຍ ເພື່ອຮັກສາ. ຫຼີກເວັ້ນການແຊ່ແຂງຫຼາຍ tha ແລະການລະລາຍຫຼືການເກັບຮັກສາໄວ້ໃນໄລຍະຍາວ 4 ° C.

design ການອອກແບບ primers ບໍ່ເperາະສົມ (ຕົວຢ່າງຄວາມຍາວຂອງ primer ບໍ່ພຽງພໍ, dimer ສ້າງຂຶ້ນລະຫວ່າງ primers, ແລະອື່ນ)) -ການອອກແບບ primers ຄືນໃavoid່ (ຫຼີກເວັ້ນການສ້າງ primer dimer ແລະໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງ).

A-3 ມກ²⁺ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ

g ມກ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ - ເພີ່ມປະລິມານ mg ຢ່າງເາະສົມ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.

A-4 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ

temperature ອຸນຫະພູມໃນການຫລອມສູງສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການຜູກມັດຮອງພື້ນແລະແມ່ແບບ. —— ຫຼຸດອຸນຫະພູມໃນການຫຼອມແລະປັບສະພາບໃຫ້ດີທີ່ສຸດດ້ວຍການໄລ່ສີ 2 ອົງສາ.

A-5 ເວລາຂະຫຍາຍ

time ເວລາຂະຫຍາຍສັ້ນ - ເພີ່ມເວລາການຂະຫຍາຍ.

ປະກົດການ: ຕົວຢ່າງເຊີງລົບຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນແຖບ ລຳ ດັບເປົ້າາຍ.

A-1 ການປົນເປື້ອນຂອງ PCR

■ຂ້າມການປົນເປື້ອນຂອງລໍາດັບເປົ້າorາຍຫຼືຜະລິດຕະພັນການຂະຫຍາຍ - ລະມັດລະວັງບໍ່ໃຫ້ທໍ່ສົ່ງນໍ້າທີ່ມີລໍາດັບເປົ້າinາຍຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທາງລົບຫຼືເຮັດໃຫ້ມັນໄຫຼອອກຈາກທໍ່ centrifuge. ນ້ ຳ ຢາຫຼືອຸປະກອນຄວນໄດ້ຮັບການອັດຕະໂນມັດເພື່ອ ກຳ ຈັດກົດນິວເຄຼຍທີ່ມີຢູ່, ແລະການມີການປົນເປື້ອນຄວນຖືກ ກຳ ນົດຜ່ານການທົດລອງຄວບຄຸມທາງລົບ.

ination ການປົນເປື້ອນສານ Reagent —— ວາງນໍ້າຢາແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຕໍ່າ.

A-2 Primer

g ມກ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ - ເພີ່ມປະລິມານ mg ຢ່າງເາະສົມ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.

design ການອອກແບບ primer ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ແລະລໍາດັບເປົ້າhasາຍມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນກັບລໍາດັບທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າາຍ. --- ການອອກແບບຄືນໃ່.

ປະກົດການ: ວົງຂະຫຍາຍສຽງ PCR ແມ່ນບໍ່ສອດຄ່ອງກັບຂະ ໜາດ ທີ່ຄາດໄວ້, ທັງໃຫຍ່ຫຼືນ້ອຍ, ຫຼືບາງຄັ້ງທັງສອງແຖບຂະຫຍາຍສຽງສະເພາະແລະວົງດົນຕີການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະເກີດຂຶ້ນ.

A-1 Primer

■ຄວາມສະເພາະຂອງ primer ບໍ່ດີ

—— primer ອອກແບບໃ່.

concentration ຄວາມເຂັ້ມຂອງ primer ສູງເກີນໄປ —— ເພີ່ມອຸນຫະພູມ denaturation ຢ່າງຖືກຕ້ອງແລະຍືດເວລາການເຮັດໃຫ້ເປັນ denaturation ໄດ້ດົນ.

A-2 Mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ

■ The Mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງເກີນໄປ —— ຫຼຸດຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ Mg2+ ຢ່າງເາະສົມ: ເພີ່ມປະລິມານ Mg ໃຫ້ເາະສົມ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.

A-3 Polymerase ຄວາມຮ້ອນທີ່ສຸດ

amount ປະລິມານເອນໄຊຫຼາຍເກີນໄປ - ຫຼຸດປະລິມານເອນໄຊລົງໄດ້ຢ່າງເatາະສົມໃນລະຫວ່າງ 0.5 U.

A-4 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ

temperature ອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ຫຼອມຕ່ ຳ ເກີນໄປ-ເພີ່ມອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ທີ່ເorາະສົມຫຼື ນຳ ໃຊ້ວິທີການຫຼອມທັງສອງຂັ້ນຕອນ.

ຮອບວຽນ A-5 PCR

cles ຮອບ PCR ຫຼາຍເກີນໄປ - ຫຼຸດຈໍານວນຂອງຮອບ PCR ລົງ.

A-1 Primer—— ຄວາມສະເພາະທີ່ບໍ່ດີ —— ອອກແບບ primer ໃ,່, ປ່ຽນຕໍາ ແໜ່ງ ແລະຄວາມຍາວຂອງ primer ເພື່ອເພີ່ມຄວາມສະເພາະຂອງມັນ; ຫຼືປະຕິບັດ PCR ທີ່ຕິດຢູ່.

ແມ່ແບບ A-2 DNA

—— ແມ່ແບບບໍ່ບໍລິສຸດ —— ເຮັດຄວາມສະອາດແມ່ແບບຫຼືສະກັດ DNA ດ້ວຍຊຸດເຄື່ອງເຮັດຄວາມສະອາດ.

A-3 ມກ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ

—— mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງເກີນໄປ - ຫຼຸດຜ່ອນ Mg ຢ່າງຖືກຕ້ອງ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ²⁺ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.

A-4 dNTP

—— ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTPs ສູງເກີນໄປ —— ຫຼຸດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTP ຢ່າງເາະສົມ

A-5 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ

—— ອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ຫຼອມຕໍ່າເກີນໄປ —— ເພີ່ມອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ທີ່ເroາະສົມ

A-6 ຮອບວຽນ

—— ຫຼາຍຮອບເກີນໄປ —— ເພີ່ມປະສິດທິພາບ ຈຳ ນວນຮອບວຽນ

ຂັ້ນຕອນທໍາອິດແມ່ນເລືອກ polymerase ທີ່ເາະສົມ. ປົກກະຕິ Taq polymerase ບໍ່ສາມາດກວດຄືນໄດ້ເນື່ອງຈາກຂາດກິດຈະກໍາ exonuclease 3'-5 ', ແລະຄວາມບໍ່ເຂົ້າກັນຈະຊ່ວຍຫຼຸດປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍຂອງຊິ້ນສ່ວນໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ເພາະສະນັ້ນ, Taq polymerase ປົກກະຕິບໍ່ສາມາດຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນເປົ້າlargerາຍໃຫຍ່ກວ່າ 5 kb ໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. Taq polymerase ທີ່ມີການດັດແປງພິເສດຫຼື polymerase ຄວາມຊື່ສັດສູງອື່ນ other ຄວນຖືກເລືອກເພື່ອປັບປຸງປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແລະຕອບສະ ໜອງ ກັບຄວາມຕ້ອງການຂອງການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວນານ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວອອກຍັງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປັບປ່ຽນການອອກແບບເບື້ອງຕົ້ນທີ່ເ,າະສົມ, ເວລາທີ່ບໍ່ມີຕົວຕົນ, ເວລາຂະຫຍາຍ, pH ຂອງກັນຊົນ, ແລະອື່ນ Usually. ເພື່ອປ້ອງກັນຄວາມເສຍຫາຍຂອງແມ່ແບບ, ເວລາ denaturation ຢູ່ທີ່ 94 ° C ຄວນຈະຫຼຸດລົງເປັນ 30 ວິນາທີຫຼື ໜ້ອຍ ກ່ວາຕໍ່ຮອບ, ແລະເວລາທີ່ຈະເພີ່ມອຸນຫະພູມເປັນ 94 ° C ກ່ອນການຂະຫຍາຍຄວນ ໜ້ອຍ ກວ່າ 1 ນາທີ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ການຕັ້ງອຸນຫະພູມຂະຫຍາຍຢູ່ທີ່ປະມານ 68 ° C ແລະການອອກແບບເວລາຂະຫຍາຍຕາມອັດຕາ 1 kb/min ສາມາດຮັບປະກັນການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວອອກໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.

ອັດຕາຄວາມຜິດພາດຂອງການຂະຫຍາຍ PCR ສາມາດຫຼຸດລົງໄດ້ໂດຍການໃຊ້ DNA polymerases ຕ່າງ with ດ້ວຍຄວາມຊື່ສັດສູງ. ໃນບັນດາໂປຼຕີນທັງTaົດຂອງ Taq DNA ທີ່ພົບມາຮອດປະຈຸບັນ, ເອນໄຊ Pfu ມີອັດຕາຄວາມຜິດພາດຕໍ່າສຸດແລະຄວາມຊື່ສັດສູງສຸດ (ເບິ່ງຕາຕະລາງຄັດຕິດ). ນອກ ເໜືອ ໄປຈາກການຄັດເລືອກເອນໄຊ, ນັກຄົ້ນຄວ້າຍັງສາມາດຫຼຸດອັດຕາການກາຍພັນຂອງ PCR ຕື່ມອີກໂດຍການປັບປຸງເງື່ອນໄຂປະຕິກິລິຍາໃຫ້ດີທີ່ສຸດ, ລວມທັງການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງສ່ວນປະກອບຂອງສານກັນບູດ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ polymerase ທີ່ມີຄວາມຮ້ອນທີ່ສຸດແລະການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງcycleາຍເລກຮອບວຽນ PCR.