ກິດຈະກໍາ DNA Polymerase 1 ໜ່ວຍ (U) Taq Plus ໄດ້ຖືກກໍານົດເປັນຈໍານວນຂອງເອນໄຊທີ່ຕ້ອງການເພື່ອລວມເອົາ 10 nmol deoxynucleotides ເຂົ້າໄປໃນສານທີ່ບໍ່ສາມາດລະລາຍໃນອາຊິດໄດ້ທີ່ 74 ° C ພາຍໃນ 30 ນາທີໂດຍນໍາໃຊ້ DNA ເຊື້ອອະສຸຈິ salmon ທີ່ຖືກກະຕຸ້ນເປັນແມ່ແບບ/primer.
ຄວາມບໍລິສຸດໂດຍການກວດຫາ SDS-PAGE ແມ່ນຫຼາຍກວ່າ 99%; ບໍ່ພົບກິດຈະກໍາຂອງ nuclease exogenous; ພັນທຸກໍາສໍາເນົາອັນດຽວຢູ່ໃນກໍາມະພັນຂອງມະນຸດສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ; ບໍ່ມີການປ່ຽນແປງກິດຈະກໍາທີ່ສໍາຄັນເມື່ອເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລານຶ່ງອາທິດ.
Taq Plus DNA Polymerase ມີກິດຈະກໍາ exonuclease 5′-3 and ແລະກິດຈະກໍາ exonuclease 3′-5. ຜະລິດຕະພັນ PCR ສາມາດຖືກໂຄນໂດຍກົງໃສ່ vector TA. ຖ້າຕ້ອງການປັບປຸງປະສິດທິພາບຂອງການເຮັດໂຄນ, ແນະ ນຳ ໃຫ້ເຮັດຄວາມສະອາດຜະລິດຕະພັນ PCR ກ່ອນແລະປະຕິບັດ A-tailing ກ່ອນທີ່ຈະໂຄນເຂົ້າໄປໃນ vector TA.
One-tube Taq Plus PCR Mix (ການຢັ້ງຢືນຜະລິດຕະພັນເຕັກໂນໂລຍີສູງລະດັບຊາດ)
Ta ການປະສົມ Taq Plus PCR ໄດ້ປັບປຸງຄວາມສະເພາະແລະຄວາມອ່ອນໄຫວຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ແລະສາມາດຂະຫຍາຍແມ່ແບບທີ່ຊັບຊ້ອນດ້ວຍເນື້ອໃນ GC ສູງ, ໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງແລະສິ່ງທີ່ຄ້າຍຄືກັນ. ຕ່ ຳ ສຸດ 2 ສະບັບຂອງແມ່ແບບເປົ້າcanາຍສາມາດຂະຫຍາຍອອກໄດ້, ຮັບປະກັນຜົນການທົດລອງທີ່ຖືກຕ້ອງຫຼາຍຂຶ້ນ.
formula ສູດ Taq Plus PCR Mix ທີ່ເປັນເອກະລັກສະເພາະເຮັດໃຫ້ລະບົບປະຕິກິລິຍາທັງstableົດມີຄວາມstableັ້ນຄົງຫຼາຍ, ແລະກິດຈະ ກຳ ຈະບໍ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກການແຊ່ແຂງລະລາຍຫຼືການເກັບຮັກສາໄວ້ດົນນານຢູ່ທີ່ 4 ° C.
solution ວິທີແກ້ໄຂປະສົມ PCR ທີ່ກຽມໄວ້ລ່ວງ ໜ້າ ທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະມີປະສິດທິພາບສາມາດເຮັດໃຫ້ການດໍາເນີນງານໄວແລະລຽບງ່າຍ, ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມແຮງຂອງແຮງງານແລະຄວາມຜິດພາດໃນການເກັບຕົວຢ່າງ. ເຄື່ອງເພີ່ມປະສິດທິພາບແລະປະສິດທິພາບ PCR ທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງແມ່ນລວມຢູ່ໃນເຄື່ອງປະສົມເຊັ່ນກັນ, ເຊິ່ງຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຕ້ອງການໃນເງື່ອນໄຂ PCR.
product ຜະລິດຕະພັນນີ້ມີທັງລະບົບປະກອບດ້ວຍສານສີແລະບໍ່ມີສີຍ້ອມ. ຜະລິດຕະພັນປະສົມ PCR ທີ່ມີສີຍ້ອມຜ້າສາມາດຖືກໄຟຟ້າໂດຍກົງຫຼັງຈາກ PCR, ໂດຍບໍ່ຕ້ອງເພີ່ມຕົວປ້ອງກັນຕົວຢ່າງ.
ມັນຖືກນໍາໃຊ້ທົ່ວໄປສໍາລັບການຂະຫຍາຍແມ່ແບບທີ່ມີຄວາມຊື່ສັດສູງແລະໂຄງສ້າງທີ່ຊັບຊ້ອນ, ເຊັ່ນວ່າເນື້ອໃນ GC ສູງແລະໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງ. ໃນກໍລະນີຫຼາຍທີ່ສຸດ, ມັນສາມາດທົດແທນ Taq DNA polymerase.
ຜະລິດຕະພັນທັງຫມົດສາມາດໄດ້ຮັບການປັບແຕ່ງສໍາລັບ ODM/OEM. ສໍາລັບລາຍລະອຽດ,ກະລຸນາຄລິກບໍລິການລູກຄ້າ (ODM/OEM)
ໃຊ້ DNA ພັນທຸ ກຳ ເປັນແມ່ແບບເພື່ອຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນ 1 kb. ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາ PCR, ເອົາ 5 μlສໍາລັບການກວດຫາ electrophoresis. |
ແມ່ແບບ A-1
template ແມ່ແບບປະກອບດ້ວຍສິ່ງປົນເປື້ອນທາດໂປຼຕີນຫຼືຕົວຍັບຍັ້ງ Taq, ແລະອື່ນ — —— ເຮັດຄວາມສະອາດແມ່ແບບ DNA, ກຳ ຈັດສິ່ງເປິເປື້ອນຂອງໂປຣຕີນຫຼືສະກັດເອົາແມ່ແບບ DNA ອອກພ້ອມກັບຊຸດເຄື່ອງກັ່ນຕອງ.
■ການປະຕິເສດແມ່ແບບບໍ່ສົມບູນແບບ - ເພີ່ມອຸນຫະພູມທີ່ມີຄວາມບໍ່ສົມດຸນຢ່າງເiatelyາະສົມແລະຍືດເວລາຂອງການເຮັດໃຫ້ມີການຄໍ້າປະກັນໄດ້ຢ່າງເາະສົມ.
rad ການເສື່ອມສະພາບຂອງແມ່ແບບ —— ກະກຽມແມ່ແບບຄືນໃ່.
A-2 Primer
quality ຄຸນນະພາບທີ່ບໍ່ດີຂອງ primers —— ສັງເຄາະສີ primer ຄືນໃ່.
rad ການເສື່ອມປະສິດທິພາບຂອງ primer —— ລວບລວມເອົາ primers ທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມສູງໃສ່ໃນປະລິມານ ໜ້ອຍ ເພື່ອຮັກສາ. ຫຼີກເວັ້ນການແຊ່ແຂງຫຼາຍ tha ແລະການລະລາຍຫຼືການເກັບຮັກສາໄວ້ໃນໄລຍະຍາວ 4 ° C.
design ການອອກແບບ primers ບໍ່ເperາະສົມ (ຕົວຢ່າງຄວາມຍາວຂອງ primer ບໍ່ພຽງພໍ, dimer ສ້າງຂຶ້ນລະຫວ່າງ primers, ແລະອື່ນ)) -ການອອກແບບ primers ຄືນໃavoid່ (ຫຼີກເວັ້ນການສ້າງ primer dimer ແລະໂຄງສ້າງຂັ້ນສອງ).
A-3 ມກ2+ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ
g ມກ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ - ເພີ່ມປະລິມານ mg ຢ່າງເາະສົມ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.
A-4 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ
temperature ອຸນຫະພູມໃນການຫລອມສູງສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການຜູກມັດຮອງພື້ນແລະແມ່ແບບ. —— ຫຼຸດອຸນຫະພູມໃນການຫຼອມແລະປັບສະພາບໃຫ້ດີທີ່ສຸດດ້ວຍການໄລ່ສີ 2 ອົງສາ.
A-5 ເວລາຂະຫຍາຍ
time ເວລາຂະຫຍາຍສັ້ນ - ເພີ່ມເວລາການຂະຫຍາຍ.
ປະກົດການ: ຕົວຢ່າງເຊີງລົບຍັງສະແດງໃຫ້ເຫັນແຖບ ລຳ ດັບເປົ້າາຍ.
A-1 ການປົນເປື້ອນຂອງ PCR
■ຂ້າມການປົນເປື້ອນຂອງລໍາດັບເປົ້າorາຍຫຼືຜະລິດຕະພັນການຂະຫຍາຍ - ລະມັດລະວັງບໍ່ໃຫ້ທໍ່ສົ່ງນໍ້າທີ່ມີລໍາດັບເປົ້າinາຍຢູ່ໃນຕົວຢ່າງທາງລົບຫຼືເຮັດໃຫ້ມັນໄຫຼອອກຈາກທໍ່ centrifuge. ນ້ ຳ ຢາຫຼືອຸປະກອນຄວນໄດ້ຮັບການອັດຕະໂນມັດເພື່ອ ກຳ ຈັດກົດນິວເຄຼຍທີ່ມີຢູ່, ແລະການມີການປົນເປື້ອນຄວນຖືກ ກຳ ນົດຜ່ານການທົດລອງຄວບຄຸມທາງລົບ.
ination ການປົນເປື້ອນສານ Reagent —— ວາງນໍ້າຢາແລະເກັບຮັກສາໄວ້ໃນອຸນຫະພູມຕໍ່າ.
A-2 Primer
g ມກ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ - ເພີ່ມປະລິມານ mg ຢ່າງເາະສົມ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.
design ການອອກແບບ primer ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ແລະລໍາດັບເປົ້າhasາຍມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນກັບລໍາດັບທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າາຍ. --- ການອອກແບບຄືນໃ່.
ປະກົດການ: ວົງຂະຫຍາຍສຽງ PCR ແມ່ນບໍ່ສອດຄ່ອງກັບຂະ ໜາດ ທີ່ຄາດໄວ້, ທັງໃຫຍ່ຫຼືນ້ອຍ, ຫຼືບາງຄັ້ງທັງສອງແຖບຂະຫຍາຍສຽງສະເພາະແລະວົງດົນຕີການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະເກີດຂຶ້ນ.
A-1 Primer
■ຄວາມສະເພາະຂອງ primer ບໍ່ດີ
—— primer ອອກແບບໃ່.
concentration ຄວາມເຂັ້ມຂອງ primer ສູງເກີນໄປ —— ເພີ່ມອຸນຫະພູມ denaturation ຢ່າງຖືກຕ້ອງແລະຍືດເວລາການເຮັດໃຫ້ເປັນ denaturation ໄດ້ດົນ.
A-2 Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ
■ The Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງເກີນໄປ —— ຫຼຸດຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ Mg2+ ຢ່າງເາະສົມ: ເພີ່ມປະລິມານ Mg ໃຫ້ເາະສົມ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.
A-3 Polymerase ຄວາມຮ້ອນທີ່ສຸດ
amount ປະລິມານເອນໄຊຫຼາຍເກີນໄປ - ຫຼຸດປະລິມານເອນໄຊລົງໄດ້ຢ່າງເatາະສົມໃນລະຫວ່າງ 0.5 U.
A-4 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ
temperature ອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ຫຼອມຕ່ ຳ ເກີນໄປ-ເພີ່ມອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ທີ່ເorາະສົມຫຼື ນຳ ໃຊ້ວິທີການຫຼອມທັງສອງຂັ້ນຕອນ.
ຮອບວຽນ A-5 PCR
cles ຮອບ PCR ຫຼາຍເກີນໄປ - ຫຼຸດຈໍານວນຂອງຮອບ PCR ລົງ.
A-1 Primer—— ຄວາມສະເພາະທີ່ບໍ່ດີ —— ອອກແບບ primer ໃ,່, ປ່ຽນຕໍາ ແໜ່ງ ແລະຄວາມຍາວຂອງ primer ເພື່ອເພີ່ມຄວາມສະເພາະຂອງມັນ; ຫຼືປະຕິບັດ PCR ທີ່ຕິດຢູ່.
ແມ່ແບບ A-2 DNA
—— ແມ່ແບບບໍ່ບໍລິສຸດ —— ເຮັດຄວາມສະອາດແມ່ແບບຫຼືສະກັດ DNA ດ້ວຍຊຸດເຄື່ອງເຮັດຄວາມສະອາດ.
A-3 ມກ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ
—— mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງເກີນໄປ - ຫຼຸດຜ່ອນ Mg ຢ່າງຖືກຕ້ອງ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນ: ເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງ Mg2+ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໂດຍຊຸດປະຕິກິລິຍາຈາກ 1 mM ຫາ 3 mM ໂດຍມີໄລຍະຫ່າງ 0.5 mM ເພື່ອກໍານົດ Mg ທີ່ດີທີ່ສຸດ2+ ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງແຕ່ລະແມ່ແບບແລະ primer.
A-4 dNTP
—— ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTPs ສູງເກີນໄປ —— ຫຼຸດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ dNTP ຢ່າງເາະສົມ
A-5 ອຸນຫະພູມອ່ອນເພຍ
—— ອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ຫຼອມຕໍ່າເກີນໄປ —— ເພີ່ມອຸນຫະພູມໃນການຫຼໍ່ທີ່ເroາະສົມ
A-6 ຮອບວຽນ
—— ຫຼາຍຮອບເກີນໄປ —— ເພີ່ມປະສິດທິພາບ ຈຳ ນວນຮອບວຽນ
ຂັ້ນຕອນທໍາອິດແມ່ນເລືອກ polymerase ທີ່ເາະສົມ. ປົກກະຕິ Taq polymerase ບໍ່ສາມາດກວດຄືນໄດ້ເນື່ອງຈາກຂາດກິດຈະກໍາ exonuclease 3'-5 ', ແລະຄວາມບໍ່ເຂົ້າກັນຈະຊ່ວຍຫຼຸດປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍຂອງຊິ້ນສ່ວນໄດ້ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ເພາະສະນັ້ນ, Taq polymerase ປົກກະຕິບໍ່ສາມາດຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນເປົ້າlargerາຍໃຫຍ່ກວ່າ 5 kb ໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. Taq polymerase ທີ່ມີການດັດແປງພິເສດຫຼື polymerase ຄວາມຊື່ສັດສູງອື່ນ other ຄວນຖືກເລືອກເພື່ອປັບປຸງປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍແລະຕອບສະ ໜອງ ກັບຄວາມຕ້ອງການຂອງການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວນານ. ນອກຈາກນັ້ນ, ການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວອອກຍັງຮຽກຮ້ອງໃຫ້ມີການປັບປ່ຽນການອອກແບບເບື້ອງຕົ້ນທີ່ເ,າະສົມ, ເວລາທີ່ບໍ່ມີຕົວຕົນ, ເວລາຂະຫຍາຍ, pH ຂອງກັນຊົນ, ແລະອື່ນ Usually. ເພື່ອປ້ອງກັນຄວາມເສຍຫາຍຂອງແມ່ແບບ, ເວລາ denaturation ຢູ່ທີ່ 94 ° C ຄວນຈະຫຼຸດລົງເປັນ 30 ວິນາທີຫຼື ໜ້ອຍ ກ່ວາຕໍ່ຮອບ, ແລະເວລາທີ່ຈະເພີ່ມອຸນຫະພູມເປັນ 94 ° C ກ່ອນການຂະຫຍາຍຄວນ ໜ້ອຍ ກວ່າ 1 ນາທີ. ຍິ່ງໄປກວ່ານັ້ນ, ການຕັ້ງອຸນຫະພູມຂະຫຍາຍຢູ່ທີ່ປະມານ 68 ° C ແລະການອອກແບບເວລາຂະຫຍາຍຕາມອັດຕາ 1 kb/min ສາມາດຮັບປະກັນການຂະຫຍາຍຊິ້ນສ່ວນທີ່ຍາວອອກໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.
ອັດຕາຄວາມຜິດພາດຂອງການຂະຫຍາຍ PCR ສາມາດຫຼຸດລົງໄດ້ໂດຍການໃຊ້ DNA polymerases ຕ່າງ with ດ້ວຍຄວາມຊື່ສັດສູງ. ໃນບັນດາໂປຼຕີນທັງTaົດຂອງ Taq DNA ທີ່ພົບມາຮອດປະຈຸບັນ, ເອນໄຊ Pfu ມີອັດຕາຄວາມຜິດພາດຕໍ່າສຸດແລະຄວາມຊື່ສັດສູງສຸດ (ເບິ່ງຕາຕະລາງຄັດຕິດ). ນອກ ເໜືອ ໄປຈາກການຄັດເລືອກເອນໄຊ, ນັກຄົ້ນຄວ້າຍັງສາມາດຫຼຸດອັດຕາການກາຍພັນຂອງ PCR ຕື່ມອີກໂດຍການປັບປຸງເງື່ອນໄຂປະຕິກິລິຍາໃຫ້ດີທີ່ສຸດ, ລວມທັງການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງສ່ວນປະກອບຂອງສານກັນບູດ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ polymerase ທີ່ມີຄວາມຮ້ອນທີ່ສຸດແລະການເພີ່ມປະສິດທິພາບຂອງcycleາຍເລກຮອບວຽນ PCR.
ນັບຕັ້ງແຕ່ການສ້າງຕັ້ງ, ໂຮງງານຂອງພວກເຮົາໄດ້ພັດທະນາຜະລິດຕະພັນລະດັບໂລກອັນທໍາອິດໂດຍຍຶດັ້ນຫຼັກການ
ຂອງຄຸນນະພາບຄັ້ງທໍາອິດ. ຜະລິດຕະພັນຂອງພວກເຮົາໄດ້ຮັບຊື່ສຽງໂດ່ງດັງໃນອຸດສາຫະກໍາແລະເປັນທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ໃນບັນດາລູກຄ້າໃand່ແລະເກົ່າ.